通过毛细管通道聚合物（C-CP）纤维固定相分离牛乳源性细胞外囊泡

细胞外囊泡（EVs）由所有类型的细胞释放到细胞外环境中。其中一部分称为外泌体的EVs大小在30至200纳米之间，由于其作为细胞间通讯载体的功能而具有生化兴趣。它们能够运输蛋白质和遗传物质，使其成为基因治疗中理想的载体。在生物治疗领域，牛乳源性细胞外囊泡（MDEVs）因其作为替代其他外泌体来源用于治疗传递的潜力而备受关注。牛乳因其复杂的胶体基质而带来独特的挑战，这种基质主要由脂肪和像酪蛋白这样的蛋白质组成，形成表现出类似外泌体特性的微粒，特别是大小和密度。面对像牛奶这样复杂的基质，传统的基于大小/密度的分离方法，包括超速离心和尺寸排阻色谱法，在实际时间和成本范围内难以提供高纯度的产量。当与逐步疏水作用层析（HIC）梯度结合时，聚酯（PET）毛细管通道聚合物（C-CP）纤维在柱和旋下尖端格式中已被有效用于从多种来源分离外泌体。本文展示了PET C-CP纤维柱从预处理的生牛奶中分离MDEVs的能力，在不到20分钟的时间内产生1.5 × 10^10颗粒/mL的浓度，纯度约为~2 × 10^10 EVs/µg蛋白质。分离过程的有效性通过一系列表征方法进行了验证。使用PET C-CP纤维柱进行MDEV分离解决了传统分离方法所面临的问题，有望扩大规模应用于治疗。

图1 描述了最终牛乳样品处理流程，以进行C-CP纤维程序。将100 µL上清液注入安装在Ultimate 3000 HPLC上的聚酯C-CP纤维柱中进行分离。

图2 通过PET C-CP纤维柱从原始过滤脱脂牛奶中分离乳源性外泌体的HIC色谱图。 注射体积 = 20 µL。 梯度步骤开始后约3分钟出现物种洗脱，反映了流体/柱的传输时间。

图3 通过PET C-CP纤维柱从1:1稀释的原始过滤脱脂牛奶中分离乳源性外泌体的HIC色谱图。 注射体积 = 100 µL。 梯度步骤开始后约3分钟出现物种洗脱，反映了柱的传输时间。

图4 代表性的HIC色谱图，显示1:1 PBS稀释的原始过滤脱脂牛奶在注射前用不同浓度（1%-6%）的乙酸处理。 注射体积 = 100 µL。

图5 1:1 PBS稀释的原始过滤脱脂牛奶经6%乙酸处理并过滤后的代表性HIC色谱图。 注射体积 = 100 µL。

图6 透射电子显微镜图像：a) 酸沉淀前稀释的原始牛奶（500 nm标尺），b) 酸沉淀后稀释的原始牛奶（2 µm标尺），c) 分离的EVs展示预期的大小范围（30-200 nm）（200 nm标尺），d) 单个EV隔离后清晰显示完整的脂质双层和杯状形状（500 nm标尺）。

图7 通过NanoFCM Nanoanalyzer测量的光散射数据的粒子大小分布直方图，显示n = 3次试验的中位结果。 校准数据显示粒子密度为2.71 × 10^8 particles/mL，平均粒子直径为68.8 nm，模式为53.8 nm。

图8 代表性的NanoFCM生成的完整过程分离物荧光响应点图。 a) 测量空白，未进行标记。 b) 基于抗CD81-FITC Ab标记鉴定MDEVs。 c) 使用MEMGlow™和抗CD81-FITC Ab双重标记进行全面鉴定。

图9 通过Bradford测定法测得的原始牛奶、6% Ac预处理牛奶注射、蛋白质和EV组分的总蛋白质含量（µg/mL）。 RIPA裂解的EV分离物的micro-BCA测定结果也显示在500 ng加载的EV裂解物和纯β-酪蛋白的代表性SDS-PAGE/免疫印迹图像中。 两种蛋白质测定均使用β-酪蛋白作为标准曲线。

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