基于纤维素纳米纤维EV片的新型外泌体分析方法

我的研究小组最近开发了一种使用纤维素纳米纤维（CNF）片来分离细胞外囊泡（EVs）的新方法，称为EV片。这些EV片设计有可调孔径。包括外泌体在内的EVs在细胞通讯中起着关键作用，是疾病机制的关键目标。EV片可以从少量生物液体（如器官表面）中捕获完整的EVs，并在干燥条件下储存直到分析。这些EV片解决了当前EV研究中的局限性。CNF片通过有效分离和保存来自仅10 µL生物液体的EVs提供了突破。在卵巢癌模型和患者样本中，EV片揭示了EV谱型的空间异质性，并根据其位置识别出独特的miRNA特征。这种技术可以在出现明显症状（如腹水）之前，在早期阶段检测到癌症相关的miRNA。重要的是，从肿瘤表面获得的miRNA谱型与周围液体中的不同，这有助于更好地理解肿瘤来源的EVs。EV片分离方法具有高EV回收效率，并且与小RNA测序兼容，展示了其在癌症诊断、分期和治疗计划方面的潜力。EV片还具有在EV保存和运输方面的优势，使其在临床和研究应用中非常实用。此外，这种方法对于阐明EV生物学，特别是在癌症进展和细胞间通讯中的作用非常有前景。未来的研究将致力于改进这一方法，以实现更广泛的应用，并最大化其潜力。

传统的细胞外囊泡（EVs）分离方法……

摘要：我的研究小组最近开发了一种使用纤维素纳米纤维（CNF）片来分离细胞外囊泡（EVs）的新方法，称为EV片，这些EV片设计有可调孔径。包括外泌体在内的EVs在细胞通讯中起着关键作用，是疾病机制的关键目标。EV片可以从少量生物液体（如器官表面）中捕获完整的EVs，并在干燥条件下储存直到分析。这些EV片解决了当前EV研究中的局限性。CNF片通过有效分离和保存来自仅10 µL生物液体的EVs提供了突破。在卵巢癌模型和患者样本中，EV片揭示了EV谱型的空间异质性，并根据其位置识别出独特的miRNA特征。这种技术可以在出现明显症状（如腹水）之前，在早期阶段检测到癌症相关的miRNA。重要的是，从肿瘤表面获得的miRNA谱型与周围液体中的不同，这有助于更好地理解肿瘤来源的EVs。EV片分离方法具有高EV回收效率，并且与小RNA测序兼容，展示了其在癌症诊断、分期和治疗计划方面的潜力。EV片还具有在EV保存和运输方面的优势，使其在临床和研究应用中非常实用。此外，这种方法对于阐明EV生物学，特别是在癌症进展和细胞间通讯中的作用非常有前景。未来的研究将致力于改进这一方法，以实现更广泛的应用，并最大化其潜力。

关键词：外泌体，细胞外囊泡，纤维素纳米纤维，异质性，生物标志物

亮点

• 基于纤维素纳米纤维的细胞外囊泡（EVs）片有效地捕获并保存了来自微量生物液体的EVs，实现了高纯度分离和稳定存储，适用于先进的分子分析。

• 使用EV片进行空间分析揭示了卵巢癌中基于位置的独特miRNA谱型，有助于早期检测并提高了对肿瘤来源囊泡生物学的理解。

• 这种创新的EV片技术具有潜在的临床应用，包括癌症诊断、分期和治疗计划，并通过非侵入性和精确的分子谱型方法推进了EV研究。

引言

细胞外囊泡（EVs），包括外泌体，是被细胞主动分泌的脂质双层颗粒，在细胞间通讯中起着重要作用[1]。它们将生物活性分子（如蛋白质、脂质和小RNA）运送到受体细胞，从而影响多种生物过程，包括免疫调节、血管生成和转移。由于EVs能够反映亲代细胞的分子状态，因此它们是疾病诊断、监测和治疗干预的有希望的生物标志物[2]。

尽管EV研究取得了进展，但在人体内EV的空间异质性方面仍存在重大挑战[3]。如表1所示，传统的EV分离技术（如超速离心、尺寸排阻色谱或免疫亲和法）各有优缺点，通常需要大量样品[4]。使用EV片进行EV分离比其他方法显著更容易，所需时间更少，且不易受到个体差异的影响。此外，这种材料由纯纤维素组成，成本可能较低。此外，关于位置特异性EV特征的重要信息在获取体液后会丢失。这对于诸如腹水这样的微环境尤其成问题，其中EVs可能因其靠近原发肿瘤或转移组织而表现出不同的分子谱型。

了解EV的空间动态对于癌症生物学至关重要。例如，在卵巢癌中，腹水中的EVs在肿瘤进展、免疫逃逸和转移中起着关键作用[5, 6]。然而，腹水中不同区域（如肿瘤表面、肝脏或盆腔腹膜）EVs的异质性仍未被探索。这是由于缺乏直接从器官表面或手术过程中微量生物液体中捕获EVs的技术。然而，目前还没有工具可以解决这些问题。

用于EV分离的CNF片

为了解决这些限制，我的研究小组开发并引入了纤维素纳米纤维（CNF）EV片作为EV分离和分析的突破性平台[7]。EV片具有生物相容性、高吸水性，并能够从微量生物液体或湿润组织表面捕获EVs。通过调整EV片的纳米结构（图1），开发了一种新的方法，能够高效、高纯度地捕获、保存和分析EVs及其小RNA载荷。EV片的实用性已在小鼠卵巢癌模型和临床样本中得到验证，揭示了特定位置的EV异质性及其在癌症进展和生物标志物发现中的意义。

本研究中开发的EV片采用定制的多孔纳米结构，能够高效捕获和存储EVs。该过程包括三个主要步骤：（1）通过毛细管吸入EV片的纳米孔来捕获EVs；（2）通过干燥关闭纳米孔以保护EV完整性来保存EVs；（3）在磷酸盐缓冲盐水中释放EVs以进行下游分析。这种方法允许从仅10 µL的生物液体中分离EVs，克服了传统超速离心技术的局限性。

与传统方法相比，EV片在EV回收效率和纯度方面表现更好。与超速离心相比，EV片从更少体积的生物液体中回收了更高浓度的完整EVs，且自由miRNA或蛋白质的污染最小。冷冻电子显微镜确认了EV片捕获的EVs的结构完整性，而免疫印迹和纳米颗粒跟踪分析验证了CD63和CD81等EV标记的存在。EV片捕获的EVs大小约为100 nm，表明大多数EVs是外泌体而不是其他较大的囊泡。关于纯度，由于EV片所需的体积较小，难以直接比较EV片与其他方法的性能。然而，通过将浓度除以蛋白质含量计算得出的纯度，EV片甚至高于常规连续离心方法在血清中的纯度。

使用小鼠卵巢癌模型，本研究表明EV片可以直接从器官表面捕获EVs。注射ID8卵巢癌细胞的小鼠在早期阶段在腹腔内显示肿瘤进展，但没有明显的腹水。附着在各种器官上的EV片，包括盆腔腹膜、肝脏表面和大网膜，成功捕获了EVs。小RNA测序揭示了不同解剖位置EVs的不同miRNA谱型。例如，mmu-miR-615-3p和mmu-miR-196b-5p在盆腔腹膜EVs中富集，而肝脏表面EVs则表现出高水平的mmu-miR-122-3p和mmu-miR-335-5p。这些发现突出了EVs的空间异质性，并表明它们的谱型受到微环境的影响。

为了在临床环境中验证，EV片在卵巢癌患者的手术中使用。EV片用环氧乙烷气体灭菌，并由日本医疗器械学会确保无菌[8]。灭菌后，EV片的分离性能没有变化。使用灭菌的EV片从肿瘤表面、腹水和邻近组织中获取EVs。小RNA测序证实，肿瘤表面EVs的miRNA谱型与肿瘤组织相似，而整个腹水EVs则显示出不同的模式。例如，已知与肿瘤进展相关的hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-429在肿瘤来源的EVs中显著富集，但在整个腹水EVs中较少。这些结果表明，EV片可以揭示以前未被认识的位置依赖性EV异质性，从而提供有关肿瘤生物学的宝贵见解。

此外，EV片在监测疾病进展和治疗反应方面的实用性也得到了证明。在一名转移性卵巢癌患者中，EV片显示来自不同解剖部位的EV miRNA谱型反映了肿瘤扩散的程度。miRNA表达水平在肿瘤破裂部位最高，并随着距离肿瘤的距离增加而降低，这表明EV介导的通信具有动态性质。重要的是，手术后hsa-miR-200c-3p和hsa-miR-429等miRNA水平下降，突显了它们作为治疗监测生物标志物的潜力。

未来展望

本研究的发现为推进EV研究及其临床应用开辟了许多可能性。首先，它们能够直接从微环境（如器官表面或局部生物液体）中捕获EVs，为EV生物学提供了一个新的维度。正如本研究所示，EVs的空间异质性表明它们携带特定微环境的分子特征，这些特征可以用于诊断和治疗目的[10]。

临床上，EV片可用于手术期间的实时EV分析，使外科医生能够根据EV miRNA谱型评估肿瘤生物学和疾病进展。这可以改善癌症分期、治疗计划和复发监测的决策。例如，肿瘤来源EVs中鉴定出的hsa-miR-200b-3p和hsa-miR-429等miRNAs可以用作检测残留病灶或早期转移的生物标志物。

进一步的研究需要扩展EV片的用途，超越小RNA谱型分析。EVs携带多种货物，包括蛋白质、脂质和DNA，可以为疾病机制提供额外的见解[1]。将蛋白质组学、脂质组学和基因组学分析与使用EV片的EV分离相结合，可以增强我们对EV生物学及其在癌症、心血管疾病和神经退行性疾病中的作用的理解。

EV片的可扩展性和生物相容性使其成为临床应用的有前途的候选者。大规模生产和监管批准对其在临床实践中的广泛应用至关重要。此外，EVs在EV片中可在干燥条件下储存一周，因为EVs的质量不会改变。因此，这种方法适合直接运输EV样品，并非常适合临床使用。需要在更大的患者队列中进行验证，以确认基于EV片的生物标志物在癌症诊断和监测中的可靠性。

结论

总之，本研究表明，EV片作为一种下一代EV分离平台，能够以空间分辨率捕获、保存和分析EVs。通过揭示EVs的位置特异性异质性，EV片为理解疾病机制、识别生物标志物和改善患者护理提供了新的机会。这项技术代表了基础EV研究和转化医学的重大进步。

利益冲突

无利益冲突需披露。

致谢

作者衷心感谢东京科技大学生命科学与技术系的Takao Yasui博士和大阪大学工业科学研究所有田广隆博士共同发明了CNF片。本工作得到了以下资助：融合导向颠覆性科学技术研究（FOREST；JPMJFR204J，AY）和日本医疗研究与发展机构（AMED）癌症研究和治疗进化项目（P-PROMOTE）拨款编号22ama221407h0001。

参考文献

1. 横井彰 和 落合孝洋, 2021. 外泌体和细胞外囊泡：重新思考癌症生物学中的基本价值。《癌症生物学研讨会》74: 79-91.

2. Liang Y., Lehrich B. M., Zheng S. and Lu M. 2021. 新兴的基于细胞外囊泡的液体活检生物标志物鉴定方法。《细胞外囊泡杂志》10: e12090.

3. Welsh J. A., Goberdhan D. C. I., O'Driscoll L., Buzas E. I., Blenkiron C., Bussolati B., Cai H., Di Vizio D., Driedonks T. A. P., Erdbrügger U., Falcon-Perez J. M., Fu Q. L., Hill A. F., Lenassi M., Lim S. K., Mahoney M. G., Mohanty S., Möller A., Nieuwland R., Ochiya T., Sahoo S., Torrecilhas A. C., Zheng L., Zijlstra A., Abuelreich S., Bagabas R., Bergese P., Bridges E. M., Brucale M., Burger D., Carney R. P., Cocucci E., Crescitelli R., Hanser E., Harris A. L., Haughey N. J., Hendrix A., Ivanov A. R., Jovanovic-Talisman T., Kruh-Garcia N. A., Küulei-Lyn Faustino V., Kyburz D., Lötvall J., Maddox A. L., Martens-Uzunova E. S., Mizenko R. R., Newman L. A., Ridolfi A., Rohde E., Rojalin T., Rowland A., Saftics A., Sandau U. S., Saugstad J. A., Shekari F., Swift S., Ter-Ovanesyan D., Tosar J. P., Useckaite Z., Valle F., Varga Z., van der Pol E., van Herwijnen M. J. C., Wauben M. H. M., Wehman A. M., Williams S., Zendrini A., Zimmerman A. J., Théry C., Witwer K. W., MISEV Consortium 2024. 细胞外囊泡研究的最小信息（MISEV2023）：从基础到高级方法。《细胞外囊泡杂志》13: e12404.

4. Gardiner C., Di Vizio D., Sahoo S., Théry C., Witwer K. W., Wauben M. and Hill A. F. 2016. 用于分离和表征细胞外囊泡的技术：全球调查的结果。《细胞外囊泡杂志》5: 32945.

5. 横井彰, 吉冈裕, 山本勇, 石川正, 伊藤司, 加藤拓, 清野贵, 武石辉, 荻山浩, 木村芳, 落合孝洋, 2017. 携带MMP1 mRNA的恶性细胞外囊泡促进卵巢癌的腹膜播散。《自然通讯》8: 14470.

6. Tian W., Lei N., Zhou J., Chen M., Guo R., Qin B., Li Y. and Chang L. 2022. 卵巢癌化疗耐药、转移和免疫逃逸中的细胞外囊泡。《细胞死亡与疾病》13: 64.

7. 横井彰, 吉田公, 木村广, 北川真, 长尾义, 饭田真, 川口真, 张明, 中山健, 山本勇, 羽生真, 荻山浩, 安井孝, 2023. 使用纤维素纳米纤维片进行空间外泌体分析揭示了细胞外囊泡的位置异质性。《自然通讯》14: 6915.

8. Rutala W. A. and Weber D. J. 2010. 医疗器械消毒和灭菌指南。《感染控制与医院流行病学》31: 107-117.

9. Park S. M., Gaur A. B., Lengyel E. and Peter M. E. 2008. miR-200家族通过靶向E-cadherin抑制因子ZEB1和ZEB2确定癌细胞的上皮表型。《基因发育》22: 894-907.

10. Möller A. and Lobb R. J. 2020. 小细胞外囊泡在癌症中的不断演变的转化潜力。《自然综述癌症》20: 697-709.

(全文结束)