扩张显微术的简史

扩张显微术允许研究人员将组织样本放大到其原始大小的20倍，从而更清晰地观察其最细微的特征。这项技术并非仅仅依赖于显微镜硬件的进步，而是通过物理方式放大样本本身。在麻省理工学院麦戈文脑研究所研究员Edward Boyden的实验室开发的方法中，研究人员使用水凝胶将样本膨胀，从而使最小的结构得以显现。

近150年前，科学家们根据当时显微镜下看到的神经元形状开始想象信息如何在大脑中流动。如今，借助现代成像技术，科学家们可以进一步放大，观察到神经元之间通信的微小突触，甚至可以看到细胞用来传递信息的分子。这些内部视图可以激发关于健康大脑如何工作的新想法，并揭示导致疾病的重要变化。

这种对生物学的更清晰视图不仅仅是因为显微镜变得更强大。利用麻省理工学院麦戈文脑研究所研究员Edward Boyden实验室开发的方法，世界各地的研究人员正在成像那些被放大到其原始大小20倍的样本，以便更清楚地看到它们最细微的特征。

Boyden说：“这是一种完全不同的显微镜方法。”“与过去300年的生物成像不同，过去的成像是通过镜头放大物体发出的光来实现的，而我们则是物理上放大物体本身。”一旦组织被扩展，即使使用广泛可用的传统显微镜硬件，研究人员也能看到更多细节。

Boyden的团队在2015年首次介绍了这种方法，他们将其命名为扩张显微术（ExM）。从那时起，他们一直在改进该方法并增加其功能，同时MIT及其他地方的研究人员也在利用它来了解生命在最小尺度上的运作方式。

“它在生物学和医学领域迅速传播，”Boyden说。“它被应用于肾病、果蝇大脑、植物种子、微生物组、阿尔茨海默病、病毒等许多领域。”

扩张显微术的起源

为了开发扩张显微术，Boyden和他的团队转向了一种具有卓越吸水性能的材料——水凝胶。这种材料已经被实际应用，例如用于一次性尿布中以保持婴儿干燥。Boyden的实验室假设，水凝胶在吸收数百倍于自身重量的水时，仍能保持其结构，并在膨胀过程中扩大其化学成分之间的空间。

经过一些实验后，Boyden的团队确定了四个关键步骤来放大组织样本以进行更好的成像。首先，必须将组织注入水凝胶。组织中的生物分子被固定在水凝胶的网状基质中，直接连接到构成水凝胶的分子上。然后，通过化学软化组织并加水，随着水凝胶吸收水分，它会膨胀，组织也会随之膨胀，均匀地生长，从而保留其成分的相对位置。

Boyden及其研究生Fei Chen和Paul Tillberg在2015年的《科学》杂志上发表了第一篇关于扩张显微术的报告。在报告中，该团队展示了通过将细胞内拥挤的分子分开，原本在标准光学显微镜下模糊在一起的特征变得分离且清晰。光学显微镜可以分辨相距约300纳米的物体——这是由物理定律限制的。通过扩张显微术，Boyden的团队报告的有效分辨率为约70纳米，实现了四倍的放大。

Boyden说，这种清晰度正是生物学家所需要的。“生物学从根本上来说是一门纳米尺度的科学，”他说。“生物分子是纳米尺度的，生物分子之间的相互作用也是在纳米尺度上发生的。生物学和医学中许多最重要的问题都涉及纳米尺度的问题。”

几种先进的显微镜技术各有优缺点，可以达到这种水平的细节。但这些方法成本高昂且需要专门技能，使得大多数研究人员无法使用。“扩张显微术使纳米成像民主化，”Boyden说。“现在，任何人都可以去观察生命的构建块及其相互关系。”

自Boyden的团队在2015年介绍扩张显微术后，世界各地的研究小组已经发表了数百篇论文，报道了他们使用扩张显微术所取得的发现。对于神经科学家来说，这项技术照亮了复杂的神经回路，揭示了特定蛋白质如何在突触处及其周围组织起来以促进神经元之间的通信，并发现了与衰老和疾病相关的改变。

对于大脑以外的研究也同样重要。Sabrina Absalon每周都在印第安纳大学医学院的实验室中使用扩张显微术来研究疟疾寄生虫，这是一种单细胞生物，内部充满了使其能够感染宿主并在宿主体内存活的特殊结构。寄生虫非常小，其中大部分结构无法用普通的光学显微镜看到。

“作为一名细胞生物学家，我失去了最大的工具——我的眼睛，”她说。通过扩张，她不仅可以看到疟疾寄生虫内的细胞器，还可以观察它们的组装过程，并跟踪寄生虫分裂时发生的变化。她说，理解这些过程可以帮助药物开发者找到干扰寄生虫生命周期的新方法。

Absalon补充说，扩张显微术的可访问性对于寄生虫学领域尤为重要，因为许多研究发生在资源有限的地区。非洲、南美洲和亚洲的工作坊和培训项目确保了这项技术能够到达直接受到疟疾和其他寄生虫影响的科学家手中。“现在他们可以用非常简单的设备获得超分辨率成像，”Absalon说。

不断改进

自2015年以来，Boyden的跨学科实验室团队找到了多种创新方法来改进扩张显微术并将其用于新用途。他们今天使用的标准技术可以实现更好的标记、更大的放大倍数和更高分辨率的成像。现在，距离小于20纳米的细胞特征可以通过光显微镜显示出来。

他们还调整了协议，使其适用于一系列重要的样本类型，从整个线虫（神经科学家、发育生物学家和其他研究人员常用）到临床样本。在这方面，他们已经证明，扩张可以帮助揭示疾病的微妙迹象，这可能有助于更早或更低成本的诊断。

最初，该团队优化了协议，以可视化细胞内的蛋白质，通过标记感兴趣的蛋白质并将它们固定在水凝胶上。通过一种新的样品处理方法，用户现在可以在同一组织上多次重新染色并进行多轮成像，因此他们可以精确定位数十种不同蛋白质的位置。这意味着研究人员可以观察分子是如何相互组织的以及它们如何相互作用，或者调查大量蛋白质，看看哪些在疾病中发生了变化。

但对于扩张显微术来说，更好的蛋白质视图只是开始。“我们想看到一切，”Boyden说。“我们希望看到每一个生物分子，精确到原子尺度。”虽然还没有达到这个目标，但通过新的探针和修改后的程序，现在可以在扩增的组织样本中看到不仅仅是蛋白质，还有RNA和脂质。

标记脂质，包括形成细胞膜的脂质，意味着研究人员现在可以在扩增的组织中看到清晰的细胞轮廓。通过扩张提供的增强分辨率，即使是神经元的细长突起也可以在图像中追踪。

通常，研究人员依靠电子显微镜生成极其详细的图像，但这需要昂贵的设备。Boyden说：“现在，你可以在普通的老式光学显微镜上获得看起来很像电子显微镜图像的东西——这种显微镜每个人都可以使用。”

Boyden说，扩张与其他尖端工具结合使用时非常强大。当使用加州大学伯克利分校HHMI研究员Eric Betzig开发的一种称为晶格光片显微镜的超快速成像方法时，整个果蝇的大脑可以在几天内以高分辨率成像。

当RNA分子被固定在水凝胶网络中并在原位测序时，科学家们可以确切地看到构建特定蛋白质的指令在细胞内的位置，这是Boyden团队与哈佛大学遗传学家George Church和当时的MIT教授Aviv Regev合作展示的。“扩张基本上提升了其他技术的分辨率，”Boyden说。“你在做质谱成像、X射线成像或拉曼成像吗？扩张刚刚升级了你的仪器。”

扩展可能性

自第一次展示扩张显微术的强大功能以来，Boyden和他的团队致力于继续提升扩张显微术的能力。“我们希望针对不同类型的问题进行优化，使技术更快、更好、更便宜总是很重要的，”他说。但扩张显微术的未来也将由Boyden实验室之外的创新者推动。“扩张不仅容易执行，而且易于修改——所以很多人正在与我们合作，甚至独立改进扩张显微术，”Boyden说。

他指出，德国哥廷根大学医学中心Silvio Rizzoli领导的一个小组与Boyden合作，已经将扩张协议适应于辨别蛋白质的物理形状。在韩国科学技术院，由前Boyden实验室博士后Jae-Byum Chang领导的研究人员已经弄清楚如何扩增整个小鼠胚胎和年轻斑马鱼的身体，与Boyden合作，为以新的细节检查发育过程和长距离神经连接奠定了基础。

利用扩张显微术可以揭示的高分辨率和分子信息，奥地利科学技术研究所的Johann Danzl及其同事开发的基于光显微镜的连接组学方法可以使绘制大脑密集神经回路的连接变得更加容易。

“扩张的魅力在于它可以让你看到生物系统最小的组成部分，”Boyden说。

他的团队决心将这种方法推向物理极限，并预计随着他们的努力，将会出现新的发现机会。“如果你能够在分子水平上绘制大脑或任何生物系统，你可能会看到它们如何作为一个网络协同工作——真正了解生命是如何运作的，”他说。

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