3D 成像揭示小鼠颅骨神经血管结构随年龄变化

本文首次通过定量评估，在颅骨内对神经亚型分布及其与血管表型的关联进行了研究，涵盖了从出生后发育到老化的整个生命周期。相比之前探索新生儿和成年颅骨的研究，我们展示了感觉神经和交感神经在4周和12周龄小鼠颅骨中与血管的独特关联。除了在骨小梁通道中观察到神经外，我们并未在皮质骨中发现神经。在出生后发育过程中，CGRP+ 和 TH+ 神经体积分数随着骨骼成熟而增加，表明神经可能在骨骼成熟过程中进一步分化和专业化。这种CGRP+ 和 TH+ 神经的增加类似于从P12到成年期背根神经节（DRG）中CGRP+ 神经百分比的增加。CGRP 已知可以刺激成骨细胞增殖和分化，同时抑制破骨细胞形成，因此CGRP+ 神经可能在维持成熟骨的更新和结构中起作用。至于TH+ 神经，TH 表达在出生后发育过程中在上颈神经节、嗅球和大脑中增加，这与组织成熟有关，颅骨中也可能类似。未来的研究需要解决出生后发育过程中特定于颅骨的 CGRP+ 和 TH+ 神经元的发展，因为它们可能在响应环境压力和骨维护中发挥重要作用。有趣的是，我们并未发现NeuF+ 神经在出生后发育中有任何显著差异。之前关于三叉神经节的研究表明，大直径神经元在小直径神经元之前成熟，这可能解释了为什么小而不髓鞘化的 CGRP+ 和 TH+ 神经在骨骼成熟过程中继续增加，而大而髓鞘化的 NeuF+ 神经则没有。

与长骨中神经的老化变化特征一致，Chartier等人报告称小鼠股骨骨膜中的神经数量减少，但神经密度没有减少，这是由于骨膜变薄所致。Steverink等人（2021）通过多变量分析发现，人类骨骼中神经随着年龄增长而减少，尤其是在骨膜中最明显。尽管颅骨和后颅骨在胚胎起源和发展路径上有差异，但颅骨也表现出神经密度随年龄下降，特别是在顶骨和额骨区域，但在冠状缝区域则没有。由于QLSM能够提供“全局”的小鼠颅骨3D读数，我们可以调查整个颅骨的差异，并定量表征特定区域。因此，我们获得了关于颅骨中神经随年龄丧失的独特见解，这种丧失在额骨中比顶骨中更早发生。由于神经已被证明对维持骨稳态和骨骼干细胞增殖是必要的，这种神经损失可能与年龄相关的骨丢失和骨脆性增加有关。相反，随着年龄的增长，神经可能变得对骨稳态不再那么重要，因为Wu等人（2016）发现在老年小鼠中下牙槽神经切断后，小梁骨和皮质骨变薄减少，而年轻和中年小鼠则没有这种情况。因此，神经在老年个体中可能不如高度再生的年轻或密集神经支配的中年个体那样调节稳态。之前的研究在骨膜和硬脑膜中都发现了神经，其中一项研究建议硬脑膜中 CGRP 染色密度更高。因此，我们将神经群体进一步划分为属于骨膜或硬脑膜的神经。然而，我们在年轻小鼠（4周龄）中并未发现 CGRP+ 神经群体在骨膜和硬脑膜之间有显著差异。尽管如此，神经在骨膜和硬脑膜中的空间分布因位置（即顶骨、冠状缝和额骨）而异。这可能解释了先前研究结果的一些差异。

我们还确定了颅骨正位神经与 CD31hiEmcnhi 血管之间的优先空间关联，这一关联在整个小鼠老化过程中得以维持。在 Qin 等人的先前研究中，TrkA 抑制后异位骨化过程中 CD31hiEmcnhi 血管数量减少，表明神经与血管之间的信号传导可能介导 CD31hiEmcnhi 血管在异位骨形成中的发展，并且在正位骨发育、稳态和愈合中也很重要。通常，已知神经控制动脉和小动脉的血管模式。此外，感觉神经中的 NGF/TrkA 信号导致 VEGF 分泌和血管生成。之前的研究已经确定了 TrkA+ 神经在发育、机械负荷反应和骨愈合过程中对血管化的作用。据我们所知，还没有研究探讨过这些相互作用中血管表型的重要性。然而，由于 CD31hiEmcnhi 血管也与骨发育和愈合呈正相关，它们可能是神经血管信号传导的先驱。尽管需要进一步研究来阐明颅骨中神经与 CD31hiEmcnhi 血管之间的相互作用，但本研究为这些相互作用的重要性提供了强有力的证据。有趣的是，尽管 CD31hiEmcnhi 血管在老年小鼠中减少，但它们的优先空间关联在整个研究年龄段中得以维持，尽管水平较低，强调了这种相互作用的重要性。

除老化外，我们还研究了颅面畸形相关基因突变对 Apert 综合征模型中神经血管结构的影响，该模型表现为子宫内早期冠状缝闭合。在 Crouzon 综合征的研究中，另一种表现为早期缝合闭合的 FGFR 相关颅缝早闭综合征，四名患者的颅骨中发现了血管直径增加。相比之下，在研究 TWIST1 突变（也表现为颅缝早闭）时，发现了正常的动脉发育，这更接近我们的发现，即我们未发现动脉样 CD31hiEmcn- 血管有差异。虽然 Apert 综合征患者存在中枢神经系统异常，但对其对颅骨周围神经的影响知之甚少，特别是受影响的颅骨中的周围神经。在这项研究中，我们未发现 Apert 综合征对颅骨神经有总体影响。在之前的研究中，TrkA 抑制导致矢状缝早闭，表明神经信号的丧失可能导致缝合闭合。相比之下，在这项研究中，冠状缝闭合后，所有三个颅骨区域，包括冠状缝中，仍然保留了神经。因此，尽管 TrkA 抑制可能导致缝合闭合，但缝合闭合并不会导致缝合区域内的神经丧失。

鉴于颅骨和大脑之间的紧密空间关联及直接物理连接，了解颅骨内的神经分布及其与血管的关联可能为发育异常、与年龄相关的认知障碍、偏头痛或简单地说，损伤再生提供重要见解。开发影响神经血管结构的方法可以为促进骨愈合疗法的设计提供信息。在这项研究中，我们获取了 C57BL/6J 小鼠顶骨和额骨中神经的3D结构和分布，并量化了其生命周期中的变化（图8）。此外，我们还表征了血管在整个生命周期中的变化以及颅骨神经与特定血管表型的空间关联。值得注意的是，我们确定了顶骨和额骨中神经生长或丧失的不同程度，以及骨膜和硬脑膜中的变化。因此，在针对损伤或疾病诱导后的神经血管浸润研究中，考虑每个特定骨或感兴趣区域的神经和血管分布及密度非常重要，因为它们可能会影响研究的成功和预期结果。

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